正当华佗热心在民间奉献自己的精湛医术时，崛起于中原动乱中的曹操，闻而相召。原来曹操早年得了一种头风病，中年以后，日益严重。每发，心乱目眩，头痛难忍。诸医施治，疗效甚微。华佗应召前来诊视后，在曹操胸椎部的鬲俞穴进针，片刻便脑清目明，疼痛立止。曹操十分高兴。但华佗却如实相告：“您的病，乃脑部痼疾，近期难于根除，须长期攻治，逐步缓解，以求延长寿命。”曹操听后，以为华佗故弄玄虚，因而心中不悦，只是未形于色。他不仅留华佗于府中，还允许他为百姓治病。公元208年，曹操操纵朝政，自任丞相，总揽军政大权，遂要华佗尽弃旁务，长留府中，专做他的侍医。这对以医济世作为终身抱负的华佗来说，要他隔绝百胜，专门侍奉一个权贵，自然是不愿意的。何况，曹操早年为报父仇，讨伐徐州的陶谦，坑杀徐州百姓数万人，尸体壅塞，泗水为之不流，接着又连屠取虑、夏丘诸县，所过“鸡义亦尽，墟邑无复行人”。徐州是华佗后期行医和居住之地，与百姓休戚与共，内心岂不愤慨！因而决心离开曹操，便托故暂回家乡，一去不归。曹操几次发信相召，华佗均以妻病为由而不从。曹操恼羞成怒，遂以验看为名，派出专使，将华佗押解许昌，严刑拷问。面对曹操的淫威，华佗坚贞不屈，矢志不移。曹操益怒，欲杀华佗。虽有谋士一再进谏，说明华佗医术高超，世间少有，天下人命所系重，望能予以宽容，但曹操一意孤行，竟下令在狱中处决。华佗临死，仍不忘济世救民，将已写好的《青囊经》取出，交狱吏说：“此书传世，可活苍生。”狱吏畏罪，不敢受书。华佗悲愤之余，只得将医书投入火中，一焚了之。后来，曹操的头风病几次发作，诸医束手，他仍无一丝悔意，还说，“佗能愈吾疾，然不为吾根治，想以此要挟，吾不杀他，病亦难愈。”直到这年冬天，曹操的爱子曹冲患病，诸医无术救治而死，这时曹操才悔恨地说：“吾悔杀华佗，才使此儿活活病死。”

华佗一生有弟子多人，其中彭城的樊阿、广陵的吴普和西安的李当之，皆闻名于世。为了将医学经验留传于后世，华佗晚年精心于医书的撰写，计有《青囊经》、《枕中灸刺经》等多部著作，可惜不传。